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免疫印跡膜(PVDF膜)的知識分享

 更新時間:2023-08-14    點擊量:3632

一、免疫印跡膜的介紹

Western blotting實驗中,NC膜和PVDF膜是最chang用的兩種膜。NC膜是特異性轉(zhuǎn)移介質(zhì)之一,使用范圍十分廣泛,也是最早用于Western blotting實驗的膜。PVDF膜是在1985年開發(fā)出來的,它能在比較苛刻的條件下(比如在酸性或堿性條件下,或者在有機(jī)溶劑存在時)將蛋白保留,因此更廣泛用于Western blotting實驗中。

二、作用機(jī)理的介紹

1.  NC

NC膜與蛋白質(zhì)之間是依靠靜電作用和疏水作用相結(jié)合的,NC膜屬于親水膜,使用前無需進(jìn)行預(yù)活化,使用方便、價格低廉、對蛋白質(zhì)的活性影響小、背景低;但其韌性較差,易損壞,從而不能反復(fù)使用,如果在非離子型去污劑作用下,結(jié)合上的蛋白比較容易被洗脫下來。

2.  PVDF

PVDF膜與蛋白質(zhì)之間是依靠疏水作用相結(jié)合的,與NC膜相比,PVDF膜有著ji好的化學(xué)穩(wěn)定性和更高的機(jī)械強(qiáng)度,適合反復(fù)檢測(reprobing)和多次剝離(stripping)。PVDF膜需要先用甲醇潤濕后才能被常規(guī)的轉(zhuǎn)膜液所浸潤,轉(zhuǎn)印緩沖液中添加的Ca2+離子能夠增強(qiáng)鈣調(diào)蛋白與Immobilon®-P轉(zhuǎn)印膜的結(jié)合,鈣的結(jié)合使蛋白質(zhì)分子形成一個疏水袋結(jié)構(gòu),從而增加蛋白與膜的結(jié)合。此外,PVDF膜具有更高的蛋白結(jié)合能力,一般NC膜的結(jié)合能力是80-100μg/cm2,而PVDF膜可以達(dá)到150-160μg/cm2。因此,PVDF膜已成為現(xiàn)階段實驗室WB的常用膜。

三、PVDF膜使用須知

1. PVDF膜為什么需預(yù)先活化?

PVDF膜本質(zhì)上是一種疏水性的聚合物,不帶電荷并具有疏水性,不能被常規(guī)轉(zhuǎn)膜液所浸潤,為了在水性緩沖液中使用,需要在使用前進(jìn)行預(yù)處理以浸潤和活化膜。最chang用的方法是使用50%v/v)或更高濃度的醇(甲醇、乙醇和異丙醇)溶液進(jìn)行浸潤和活化,使得PVDF膜中微孔內(nèi)的空氣能夠被低表面張力的甲醇所替代,從而易于后續(xù)緩沖液進(jìn)入PVDF膜中的微孔內(nèi),使得PVDF膜從疏水性轉(zhuǎn)變?yōu)橛H水性,在浸潤過程中膜的外觀會從不透明轉(zhuǎn)變?yōu)榘胪该?,此時表明PVDF膜已被wan全浸濕。然后用水反復(fù)沖洗以去除醇類,再直接將膜放入轉(zhuǎn)印緩沖液中進(jìn)行平衡。膜被浸濕后,通過電轉(zhuǎn)移,蛋白質(zhì)與膜接觸發(fā)生疏水作用而被吸附在PVDF膜上。

2. PVDF膜孔徑對蛋白結(jié)合的影響?

膜孔徑越小,膜對低分子量的蛋白結(jié)合就越牢固。首先,較小的孔徑會限制蛋白分子的運(yùn)動,減緩其轉(zhuǎn)移速度,蛋白與膜的結(jié)合就更充分,從而更容易被攔截在孔道內(nèi);其次,較小的孔徑還能提供較大的膜表面積,從而提高了蛋白與膜接觸的機(jī)會;此外,較小的孔徑也能提供更高的表面密度,從而增加了孔道與溶液間的分子間吸引力,這種吸附方式被稱為毛細(xì)作用"。SchweitzerKriz在一項研究中發(fā)現(xiàn),較小的孔徑可以增強(qiáng)其吸附能力并提供更高的蛋白密度,蛋白分子量越低,蛋白的比表面積越大,與膜接觸面越大越充分,結(jié)合就更緊密。但是,如果膜的孔徑小于0.1 μm,那么蛋白的轉(zhuǎn)移就很難進(jìn)行下去了,是因為蛋白質(zhì)分子的直徑大約在1-100 nm之間。

3. 如何選擇PVDF膜?

一般情況下,分子量大于20kD的蛋白應(yīng)選擇0.45μm的膜,分子量小于20kD的蛋白應(yīng)選擇0.2μm的膜。0.2μmPVDF膜內(nèi)部表面積大約是0.45μmPVDF膜的三倍,因此其吸附能力更高??傊x擇PVDF膜的孔徑大小需要根據(jù)樣品蛋白的特性和大小來確定,以期獲得最佳的結(jié)合效果。

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