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細(xì)胞復(fù)蘇實(shí)驗(yàn)的操作步驟與注意事項(xiàng)

 更新時(shí)間:2024-08-08    點(diǎn)擊量:850
  細(xì)胞復(fù)蘇是指將凍存在液氮或者-70℃冰箱中的細(xì)胞解凍之后重新培養(yǎng),細(xì)胞恢復(fù)生長(zhǎng)的過(guò)程。當(dāng)恢復(fù)到常溫狀態(tài)時(shí),細(xì)胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)保持正常,生化反即刻恢復(fù)。細(xì)胞復(fù)蘇過(guò)程升溫要快,原則是慢凍快融,防止在解凍過(guò)程中水分進(jìn)入細(xì)胞,形成冰晶,影響細(xì)胞存活。下面讓我們一起來(lái)看看細(xì)胞復(fù)蘇實(shí)驗(yàn)的操作步驟與注意事項(xiàng)吧!
 
  一、操作步驟
 
  1.將10ml移液管、移液槍、1ml槍頭、50ml離心管、T25培養(yǎng)瓶、酒精燈、廢液缸等物品放入超凈工作臺(tái),紫外燈照射30min后再通風(fēng)30min;
 
  2.預(yù)熱培養(yǎng)基;
 
  3.用75%酒精消毒后放入超凈工作臺(tái);
 
  4.將凍存細(xì)胞從液氮罐中取出;
 
  5.放入一次性手套于37℃水浴鍋中快速晃動(dòng)使其融化;
 
  6.用75%酒精消毒后放入超凈工作臺(tái);
 
  7.吸取9ml培養(yǎng)基到50ml離心管中;
 
  8.用1ml槍頭吸取解凍的細(xì)胞懸液于離心管中;
 
  9.1000r/min,離心5min;
 
  10.用75%酒精消毒后放入超凈工作臺(tái);
 
  11.吸棄上清液;
 
  12.吸取1ml培養(yǎng)基重懸細(xì)胞,將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)瓶?jī)?nèi),補(bǔ)加適量培養(yǎng)基,輕輕晃動(dòng)培養(yǎng)瓶使細(xì)胞分布均勻,并做好標(biāo)記;
 
  13.在顯微鏡下觀察復(fù)蘇的細(xì)胞密度及狀態(tài);
 
  14.將細(xì)胞放回二氧化碳培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)。
 
  二、注意事項(xiàng)
 
  1.從液氮罐中取出細(xì)胞時(shí),應(yīng)做好個(gè)人防護(hù)以免凍傷;
 
  2.凍存細(xì)胞取出后,如不能立即放入水浴鍋中融化,需將其放在干冰上保存轉(zhuǎn)移;
 
  3.細(xì)胞水浴解凍時(shí)間以1min內(nèi)為宜,做到慢凍速融;
 
  4.已解凍的細(xì)胞避免長(zhǎng)時(shí)間常溫存放,需盡快離心去除DMSO;
 
  5.剛復(fù)蘇的細(xì)胞貼壁尚不牢固,24h內(nèi)不要頻繁觀察和換液;
 
  6.將培養(yǎng)瓶放入培養(yǎng)箱,并將瓶蓋旋松,以便進(jìn)行充分的氣體交換(如使用透氣性瓶蓋,則無(wú)需旋松瓶蓋)。
 
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