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如何對(duì)pcr結(jié)果進(jìn)行分析?

 更新時(shí)間:2024-11-12    點(diǎn)擊量:1020

一、PCR結(jié)果分析的基本步驟?

1.基線設(shè)置?:實(shí)時(shí)PCR反應(yīng)的基線是指在PCR的初始循環(huán)期間的信號(hào)水平,通常是315個(gè)循環(huán)之間,此時(shí)熒光信號(hào)幾乎沒(méi)有變化,可以認(rèn)為是背景或反應(yīng)的噪音。

2. ?閾值設(shè)定??qPCR的閾值代表的是明顯超出基線的擴(kuò)增信號(hào)水平,用以區(qū)分明確的擴(kuò)增信號(hào)和背景。通常qPCR儀器自帶軟件會(huì)自動(dòng)將閾值設(shè)置為基線熒光值標(biāo)準(zhǔn)偏差的10倍。

3. ?CT值計(jì)算?Ct是指熒光信號(hào)超過(guò)閾值時(shí)對(duì)應(yīng)的循環(huán)數(shù),Ct值與目的基因的起始量成反比,可用于計(jì)算DNA初始拷貝數(shù)。

4. ?擴(kuò)增曲線分析?:擴(kuò)增曲線有兩種展現(xiàn)形式,一種是線性,一種是對(duì)數(shù)形式。通常用CT來(lái)推算樣品中樣品的濃度,CT值越高說(shuō)明模板濃度越低。

5. ?標(biāo)準(zhǔn)曲線?:將已知濃度的樣品(標(biāo)準(zhǔn)品)經(jīng)過(guò)梯度稀釋后分別取樣進(jìn)行熒光定量PCR,得到的一系列Ct值與Log模板數(shù)對(duì)應(yīng)可以得到一個(gè)相關(guān)的曲線,即標(biāo)準(zhǔn)曲線。這個(gè)標(biāo)準(zhǔn)曲線可以用來(lái)判斷熒光定量PCR體系的優(yōu)劣。

6. ?熔解曲線分析?PCR產(chǎn)物進(jìn)行逐步升溫監(jiān)測(cè),可以看到在達(dá)到其解鏈溫度時(shí),熒光信號(hào)會(huì)有一個(gè)忽然的下降。理論上如果PCR得到特異性產(chǎn)物則只有一個(gè)Tm值,在溶解曲線上表示只有單峰存在。如果是多相峰,可以判斷產(chǎn)物不是單一的,發(fā)生了非特異擴(kuò)增。

如何對(duì)pcr結(jié)果進(jìn)行分析?

二、不同PCR技術(shù)的結(jié)果分析方法

1. ?第一代PCR技術(shù)?:采用瓊脂糖電泳的方式對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行分析,通過(guò)電泳判斷擴(kuò)增產(chǎn)物的大小,用于臨床檢測(cè)。

2. ?第二代PCR技術(shù)?:熒光定量PCRqPCR),通過(guò)設(shè)置基線、閾值和CT值進(jìn)行定量分析,適用于需要精確測(cè)量DNARNA含量的實(shí)驗(yàn)。

3. ?第三代PCR技術(shù)?:以微滴化處理步驟為主要特征,提高了檢測(cè)的靈敏度和特異性,適用于更復(fù)雜的實(shí)驗(yàn)需求。


三、具體實(shí)驗(yàn)操作步驟

1. ?樣品處理?:將樣品進(jìn)行稀釋和離心處理,確保DNAwanquan裂解和分離。

2. ?PCR反應(yīng)?:按照試劑盒說(shuō)明書(shū)操作,將反應(yīng)管與凍干成分一起離心,添加緩沖液和引物/探針/核苷酸混合物,進(jìn)行PCR反應(yīng)。

3. ?結(jié)果分析?:通過(guò)基線、閾值、CT值和擴(kuò)增曲線等參數(shù)分析PCR結(jié)果,比較實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的差異,確定基因表達(dá)的變化。


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